Pipeline Nanopore
Introduzione
Questa pipeline analizza dati di sequenziamento del genoma completo (whole-genome sequencing, WGS) di batteri generati con tecnologia Oxford Nanopore. Filtra le long reads, ricostruisce un assemblaggio de novo e corregge la sequenza assemblata (polishing). Esegue inoltre la classificazione tassonomica, lo screening della resistenza antimicrobica (AMR), la ricerca di plasmidi e la tipizzazione in base al genere e alla specie del campione.
L'assemblaggio e il polishing utilizzano le read Nanopore filtrate.
AMRFinderPlus e gli strumenti di tipizzazione vengono eseguiti in base ai taxa supportati. Per Klebsiella, l'analisi MLST viene effettuata con Kleborate.
Lancia la pipeline
Una volta selezionata la Nanopore Pipeline nella pagina di lancio analisi, un'interfaccia di conferma consente di procedere alla selezione degli input e dei parametri.
La Nanopore Pipeline è composta da 5 fasi principali:
- Filtraggio delle read lunghe con Filtlong e valutazione della qualità delle read con NanoPlot;
- Classificazione tassonomica con Kraken2, screening AMR con ResFinder e ricerca di plasmidi con PlasmidFinder sulle read filtrate;
- Assemblaggio de novo con Autocycler e valutazione della qualità dell'assemblaggio con QUAST;
- Polishing dell'assemblaggio con Medaka, utilizzando l'intero insieme di read filtrate, seguito da QUAST;
- Screening AMR, MLST e caratterizzazione specifica per specie dell'assemblaggio corretto.
Input
L'input richiesto è un file FASTQ di read Nanopore già sottoposte a basecalling per campione (.fastq.gz), ad esempio proveniente da step_0SQ_rawreads.
Parametri principali
La tabella seguente elenca le impostazioni principali e i relativi valori predefiniti:
| Tool | Parametro | Valore predefinito | Descrizione |
|---|---|---|---|
| Filtlong | Lunghezza minima delle read | 1000 bp |
Lunghezza minima delle read conservate. |
| Filtlong | Percentuale conservata | 90 |
Conserva le read migliori che rappresentano il 90% delle basi in input, nel rispetto degli altri filtri. |
| Filtlong | Basi target | Non impostato | Limite facoltativo al numero di basi conservate. |
| Filtlong | Trimming / splitting | Disabilitato / 0 |
Rimuove porzioni delle read o le suddivide; 0 disabilita la suddivisione. |
| Autocycler | Dimensione del genoma | Automatica | Utilizza le soglie di dimensione del genoma di Qualibact per il taxon fornito. È possibile specificare una dimensione esplicita, ad esempio 5000000 o 5m. |
| Autocycler | Assemblatori | flye raven miniasm myloasm metamdbg |
Assemblatori utilizzati per ricostruire il genoma a partire da sottoinsiemi di read. |
| Autocycler | Tipo di read | ont_r10 |
Tipo di read Nanopore; i valori supportati sono ont_r9 e ont_r10. |
| Autocycler | Numero di sottoinsiemi | 4 |
Numero di sottoinsiemi di read utilizzati per l'assemblaggio; deve essere almeno 2. |
| Medaka | Modello | Automatico | Dedotto dai metadati del basecaller nelle intestazioni FASTQ; è anche possibile specificare esplicitamente un modello compatibile. |
| Medaka | Preferenza per il modello batterico | Abilitata | Seleziona il modello di metilazione batterica quando compatibile con il basecaller. |
| Medaka | Dimensione del batch | 100 |
Dimensione del batch utilizzato durante la generazione della sequenza consenso. |
Analisi specifiche per specie
La tipizzazione viene eseguita sull'assemblaggio corretto. Le seguenti analisi vengono selezionate automaticamente:
| Taxon del campione | Tool | Analisi |
|---|---|---|
| Klebsiella | Kleborate | Assegnazione della specie, seguita dalle analisi AMR, di virulenza e MLST tramite i moduli per i complessi di specie supportati. |
| Altri batteri | mlst | Identificazione dello schema MLST e del tipo di sequenza. |
| Salmonella enterica | SeqSero2 | Predizione del sierotipo. |
| Escherichia coli | SeqTyping | Predizione del sierotipo. |
| Bacillus cereus | BTyper3 | Caratterizzazione tassonomica e tipizzazione. |
Una volta lanciata la pipeline, la pagina genera un link alla sezione Controllo analisi, dove è possibile monitorare lo stato dell'esecuzione. Il sistema notifica l'utente quando la pipeline viene avviata con successo e quando l'esecuzione è completata.
Cartella dei risultati
La cartella dei risultati, Result folder, è accessibile cliccando sul link presente all'interno della scheda dell'analisi, nella sezione Dati risultato.
I risultati sono organizzati per campione e fase di analisi in results > YEAR > CMP > STEP > DS-DATE_METHOD, dove CMP identifica il campione, DS identifica il dataset di sequenziamento, DATE è la data e ora di esecuzione e METHOD identifica il tool. Ogni cartella di analisi contiene:
- meta: metadati, parametri, file di configurazione e log di esecuzione;
- result: file prodotti dall'analisi;
- qc, dove disponibile: risultati del controllo qualità in qc/result e relativi log in qc/meta.
I principali output sono elencati di seguito. I percorsi delle cartelle sono relativi a results > YEAR > CMP; * rappresenta gli identificativi del dataset e dell'esecuzione.
| Analisi | Cartella | Output principali |
|---|---|---|
| Filtraggio delle read e controllo qualità | 1PP_trimming/*_filtlong |
Read filtrate in result/*_filtlong.fastq.gz; report HTML di NanoPlot e file di testo NanoStats in qc/result. |
| Assemblaggio de novo e controllo qualità | 2AS_denovo/*_autocycler |
Assemblaggio preliminare (.fasta) e grafo di assemblaggio (.gfa) in result; riepilogo di Autocycler (.tsv) in meta; tabella QUAST in qc/result. |
| Polishing dell'assemblaggio e controllo qualità | 2AS_mapping/*_medaka_polishing |
Assemblaggio corretto in result/*_medaka_polishing_denovo.fasta; modello selezionato in meta/*_model.txt; tabella QUAST in qc/result. |
| Classificazione tassonomica | 3TX_class/*_kraken2 |
Report Kraken2 (*_kraken.tsv), tabella e visualizzazione HTML di Krona in result. |
| Screening AMR sulle read | 4AN_AMR/*_resfinder |
Report di resistenza (.txt), file di sequenza (.fsa) e risultati strutturati (.json) in result. |
| Ricerca di plasmidi | 4AN_AMR/*_plasmidfinder |
Riepilogo (*_results.tsv), allineamenti e file di sequenza in result. |
| Screening AMR sull'assemblaggio | 4AN_AMR/*_amrfinderplus |
Report AMRFinderPlus (.tsv) in result, per i taxa supportati. |
| MLST per gli altri batteri | 4TY_MLST/*_mlst |
Report MLST (.csv e .tsv) in result. |
| Caratterizzazione di Klebsiella | 3TX_species/*_kleborate, 4AN_AMR/*_kleborate e 4TY_MLST/*_kleborate |
Assegnazione della specie, report di caratterizzazione (.tsv) e risultati MLST (.csv e .tsv) nelle rispettive cartelle result. |
| Sierotipizzazione di Salmonella enterica | 4TY_serotype/*_seqsero |
Report del sierotipo (*_result.tsv) e alleli antigenici estratti (.fasta) in result. |
| Sierotipizzazione di Escherichia coli | 4TY_serotype/*_seq_typing |
Report del sierotipo (*.report_types.tab e *.report.txt) in result. |
| Caratterizzazione di Bacillus cereus | 4TY_serotype/*_btyper3 |
Risultati finali di BTyper3 in result. |
Il FASTA corretto con Medaka è l'assemblaggio finale utilizzato per la caratterizzazione successiva. Viene conservato anche l'assemblaggio preliminare di Autocycler.
Visualizzazione dei dati
Il report HTML di NanoPlot può essere aperto in un browser per esaminare la qualità e le distribuzioni delle lunghezze delle read filtrate. Il report HTML di Krona fornisce una visualizzazione interattiva della classificazione tassonomica. Le tabelle QUAST riassumono la qualità dell'assemblaggio prima e dopo il polishing.